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第六章　色譜法

　　色譜的概念與分析特點(diǎn)

　　色譜理論

　　色譜分類

　　色譜儀器基本結(jié)構(gòu)(檢測器)

　　色譜分析應(yīng)用

　　色譜基礎(chǔ)知識

　　1.色譜分析特點(diǎn)：高靈敏度、高效能、高選擇性、快速度

　　2.色譜峰三參數(shù)：峰面積(定量)、峰位(定性)、峰寬(柱效)

　　色譜理論

　　分配系數(shù)、容量因子：k=K×(Vs/Vm)=(Cs/Cm)×(Vs/Vm) ;容量因子差異是色譜分離的先決條件;分配系數(shù)差異是物質(zhì)分離的前提。

　　兩個理論

　　速率理論：渦流擴(kuò)散(小粒度均勻顆粒勻漿裝柱);傳質(zhì)阻抗(小粒度、低粘度、適當(dāng)高溫);縱向擴(kuò)散(限氣相色譜)

　　塔板理論：n=5.54(tR/Wh/2)2

　　H=L/n

　　色譜分離原理分類

　　吸附色譜：如薄層色譜

　　分配色譜：固定相為液體的液相、氣相色譜，最普遍

　　離子交換色譜：離子型物質(zhì)分離

　　分子排阻色譜：大分子物質(zhì)可利用分子大小不同而分離

　　薄層色譜

　　原理：利用A、B兩種物質(zhì)的KA≠KB而分離

　　固定相：硅膠(活化、G、H、F254)、硅藻土、氧化鋁、纖維素等

　　薄層板制備：1份固定相+3份水，同一方向研磨

　　點(diǎn)樣：距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑2-4mm;

　　檢視：顯色、熒光

　　色譜系統(tǒng)適用性：靈敏度、比移值、分離度

　　應(yīng)用

　　鑒別：比較Rf值是否一致

　　雜質(zhì)檢查：雜質(zhì)對照法、自身稀釋對照法

　　高效液相色譜法

　　原理：分配色譜、分子排阻色譜、離子交換…

　　分配色譜分類：

　　反相色譜(流動相極性大于固定相;極性強(qiáng)的先出柱;分離非極性和中等極性有機(jī)分子;固定相多為C18(ODS)和C8柱;流動相多為甲醇-水或乙腈-水;最廣泛);

　　正相色譜(流動相極性小于固定相;極性弱的先出柱;分離極性和中等極性有機(jī)分子)

　　儀器結(jié)構(gòu)

　　高壓泵

　　色譜柱(固定相：C18烷基鍵合硅膠，流動相：甲醇-水或乙腈-水)

　　進(jìn)樣閥

　　檢測器

　　濃度型：紫外檢測器、光電二極管陣列檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、質(zhì)譜檢測器

　　質(zhì)量型：蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器

　　色譜系統(tǒng)適用性

　　四參數(shù)：理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子

　　理論板數(shù)、分離度(R>1.5)、重復(fù)性(RSD≤2.0%)、拖尾因子(0.95-1.05)的計算公式

　　標(biāo)準(zhǔn)色譜分析方法中的固定因素：固定相種類、流動相組成、檢測器類型

　　應(yīng)用

　　1.鑒別：比較tR

　　2.雜質(zhì)檢查

　　內(nèi)標(biāo)法(公式)

　　外標(biāo)法(公式)

　　加校正因子(需有雜質(zhì)對照品)和不加校正因子主成分自身對照

　　面積歸一化

　　3.含量測定

　　內(nèi)標(biāo)法

　　外標(biāo)法

　　氣相色譜法

　　原理：分配色譜，分離熱穩(wěn)定蒸汽壓大的物質(zhì)

　　儀器結(jié)構(gòu)

　　氣源：氮、氦、氫

　　進(jìn)樣：頂空進(jìn)樣、直接進(jìn)樣

　　色譜柱：填充柱和毛細(xì)管柱(開管型(涂壁WCOT或涂層SCOT);填充型);SCOT應(yīng)用最多;色譜柱用前需老化

　　固定液與載體

　　固定液：烴類(角鯊?fù)椋�非極性)、硅氧烷(弱極性，應(yīng)用最廣)、醇類(氫鍵型，聚乙二醇，藥物分析常用)

　　載體：硅藻土、多孔微球

　　檢測器：火焰離子化檢測器(FID)、電子捕獲檢測器(ECD，用于含鹵素、硫、氧、等電負(fù)性強(qiáng)基團(tuán))、質(zhì)譜檢測器(MS)、熱導(dǎo)檢測器(TCD)

　　應(yīng)用(同液相色譜)

　　內(nèi)標(biāo)法

　　外標(biāo)法

　　標(biāo)準(zhǔn)加入法(消除樣本基質(zhì)的影響)

　　面積歸一化法

　　電泳法

　　原理：帶電荷物質(zhì)在電場下趟度差異而分離

　　影響因素：pH值和離子強(qiáng)度(緩沖液)、電場強(qiáng)度、樣品濃度1%

　　類型：平板電泳、毛細(xì)管電泳

　　應(yīng)用

　　鑒別：肝素鈉乳膏鑒別：瓊脂糖凝膠電泳

　　分子量測定：注射用重組人促紅素:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　純度檢查：凍干人血白蛋白純度：醋酸纖維素薄膜電泳;肉毒抗毒素純度：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　等電點(diǎn)測定：注射用重組人白介素-2等電點(diǎn)：等電聚膠電泳

　　分子組分比測定：尿激酶分子組分比：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

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